In Wuhan wird an der genetischen Veränderung von Affenpocken geforscht

Auf ScienceDirekt findet sich ein Artikel von neun Forschern der Instituts für Virologie in Wuhan, China, zum Thema „monkeypox virus“ und DNA-Zusammenbau (Gentechnik). Der Beitrag erschien zuerst am 28. Februar 2022 in Virologica Sinica, der chinesischen virologischen Fachzeitschrift.

In dem Artikel mit dem Titel „Efficient assembly of a large fragment of monkeypox virus genome as a qPCR template using dual-selection based transformation-associated recombination“ („Effizienter Zusammenbau eines großen Genomfragments des Affenpockenvirus als qPCR-Matrize durch transformationsassoziierte Rekombination auf der Grundlage von Doppelselektion“) heißt es im Abstract:

„Transformation-associated recombination (TAR) has been widely used to assemble large DNA constructs. One of the significant obstacles hindering assembly efficiency is the presence of error-prone DNA repair pathways in yeast, which results in vector backbone recircularization or illegitimate recombination products. To increase TAR assembly efficiency, we prepared a dual-selective TAR vector, pGFCS, by adding a P_ADH1-URA3 cassette to a previously described yeast-bacteria shuttle vector, pGF, harboring a PHIS3–HIS3 cassette as a positive selection marker. This new cassette works as a negative selection marker to ensure that yeast harboring a recircularized vector cannot propagate in the presence of 5-fluoroorotic acid. To prevent pGFCS bearing ura3 from recombining with endogenous ura3-52 in the yeast genome, a highly transformable Saccharomyces cerevisiae strain, VL6-48B, was prepared by chromosomal substitution of ura3-52 with a transgene conferring resistance to blasticidin. A 55-kb genomic fragment of monkeypox virus encompassing primary detection targets for quantitative PCR was assembled by TAR using pGFCS in VL6-48B. The pGFCS-mediated TAR assembly showed a zero rate of vector recircularization and an average correct assembly yield of 79% indicating that the dual-selection strategy provides an efficient approach to optimizing TAR assembly.“

Übersetzung auf Deutsch mit deepl.com:

„Die transformationsassoziierte Rekombination (TAR) wird häufig für den Zusammenbau großer DNA-Konstrukte verwendet. Eines der größten Hindernisse für die Effizienz des Zusammenbaus ist das Vorhandensein von fehleranfälligen DNA-Reparaturwegen in Hefe, die zu einer Re-Zirkularisierung des Vektorrückgrats oder zu illegitimen Rekombinationsprodukten führen. Um die Effizienz des TAR-Aufbaus zu erhöhen, haben wir einen dual-selektiven TAR-Vektor, pGFCS, hergestellt, indem wir eine PADH1-URA3-Kassette zu einem zuvor beschriebenen Hefe-Bakterien-Shuttle-Vektor, pGF, hinzugefügt haben, der eine PHIS3-HIS3-Kassette als positiven Selektionsmarker enthält. Diese neue Kassette wirkt als negativer Selektionsmarker, um sicherzustellen, dass Hefe, die einen rezirkularisierten Vektor trägt, sich in Gegenwart von 5-Fluorotinsäure nicht vermehren kann. Um zu verhindern, dass pGFCS, das Ura3 trägt, mit dem endogenen Ura3-52 im Hefegenom rekombiniert, wurde ein hochgradig transformierbarer Saccharomyces cerevisiae-Stamm, VL6-48B, durch chromosomale Substitution von Ura3-52 mit einem Transgen hergestellt, das eine Resistenz gegen Blasticidin verleiht. Ein 55-kb-Genomfragment des Affenpockenvirus, das die primären Nachweisziele für die quantitative PCR umfasst, wurde durch TAR mit pGFCS in VL6-48B assembliert. Die pGFCS-vermittelte TAR-Assemblierung zeigte eine Null-Rate der Vektor-Rezirkularisierung und eine durchschnittliche korrekte Assemblierungsausbeute von 79 %, was darauf hindeutet, dass die Dual-Selection-Strategie einen effizienten Ansatz zur Optimierung der TAR-Assemblierung bietet.“